Chromatographie sur colonne
Cette technique est analogue à la CCM (basée sur une interaction électrostatique / liaison H), sauf que c'est par gravité que l'élution se fait, et non par diffusion.
Principe
On utilise une colonne en verre équipée d'un verre fritté et d'un robinet. La colonne est remplie d'une poudre, généralement de l'alumine ou de la silice, ou une résine échangeuse d'ions. Un mélange est placé en haut de la colonne. Selon la nature de l'éluant et du contenu de la colonne, certaines molécules sont plus facilement éluées que d'autres.
Réalisation de la chromatographie
Préparation de la colonne
Lorsqu'il n'y a pas de verre fritté dans le bas de la colonne, il est nécessaire de boucher la colonne en plaçant un morceau de coton. Le coton doit être placé avec une baguette en verre.
Remplissage de la colonne.
Lors de l'opération de remplissage, le plus délicat est d'avoir une répartition la plus homogène possible de l'adsorbant. Il faut éviter :
- D'avoir un remplissage de biais.
- Des trous dans le remplissage.
- Des bulles d'air.
Proportions
Utiliser 50g d'adsorbant pour 1g de produit à séparer. Doubler voire quadrupler le rapport en cas de séparation difficile.
Il existe deux techniques de remplissage.
Lors du remplissage frapper les parois de façon à avoir un tassement maximal.
Remplissage à sec
- Remplir la colonne aux deux tiers de solvant.
- Faire couler l’adsorbant dans la colonne à l’aide d’un entonnoir en faisant attention à avoir une répartition homogène dans la colonne.
- La colonne est prête lorsque le solvant surnageant au dessus de l’adsorbant est de venu limpide.
Remplissage avec le solvant
- Préparer une bouillie en mélangeant dans un bécher l’adsorbant dans le solvant.
- Placer cette bouillie dans la colonne à l’aide d’un entonnoir en faisant attention à avoir une répartition homogène dans la colonne.
- La colonne est prête lorsque le solvant surnageant au dessus de l’adsorbant est devenu limpide.
Dépôt des produits et élution
- Le solvant doit-être juste à la hauteur de l’adsorbant.
- Ajouter le mélange à étudier à l’aide d’une pipette Pasteur tout doucement en évitant de de trop agiter la couche superficielle d'adsorbant.
- Faire éluer à raison d'une goutte toutes les 5 secondes.
L'élution peut se faire selon un gradient de solvant polaire, en faisant varier les proportions de solvant composant l'éluant. Dans ce cas, la colonne doit être préparée avec le solvant le moins polaire.
Ether de pétrole
100
96
90
80
50
20
0
Acétate d'éthyle
0
4
10
20
50
80
100
Chromato-flash
Dans certaines circonstances, on peut utiliser la technique de la "chromato-flash", où, pour gagner du temps, on monte la colonne sur une fiole à vide branchée sur une pompe.
Bibliographie
- Horowitz G. 2000 - Undergraduate Separations Utilizing Flash Chromatography - J. Chem. Educ., 77, p 263.
Chromato Flash de séparation :
- de carotènes, de chlorophylles et xanthophylles des épinards,
- du b-carotène de la tétraphényle cyclopentadiènone,
- des (+) et (-) carvone des graines de carvi et d'essence de menthe,
- du benzyle de la benzoïne.
Bibliographie expérimentale
Mélange d'acides aminés : arginine - acide aspartique
- Le Guilly L. - Séparation par méthodes chromatographiques de deux acides a-aminés présents dans un produit pharmaceutique - Bull. Un. Phys., 668, p. 269-275.
- Diehl-Jones S.M. 1984 - Chlorophyll Separation and Spectral Identification - J. Chem. Ed., 61, p. 454-456. Chromato-colonne et spectro uv-vis.
