Méthodes chromatographiques

AnimationChromatographie sur couche mince


Cette méthode très facile à mettre en oeuvre est une des principales utilisées dans les laboratoires. Elle présente l'avantage de ne nécessiter que peu de matériel et donner des résultats facilement interprétables mais pas toujours très reproductibles.

  • Mode opératoire
  • Choix du matériel
  • Choix de l'éluant
  • Chromatographie
  • Révélation

Expériences proposées


La chromatographie sur couche mince est la plus simple des méthodes chromatographiques. Elle consiste à placer sur une feuille (papier, silice ou autre, voir plus loin) une tache et de la laisser éluer en la trempant dans un solvant ou un mélange de solvant (appelé éluant), l’éluant diffuse le long du support. La tache migre sur la feuille plus ou moins vite selon la nature des interactions qu'elle subit de la part du support et de l'éluant.

cuve_face.gif (6333 octets)cuve_lateral.gif (3137 octets)


1. Principe de la chromatographie

La CCM est basée sur une interaction de type électrostatique / liaison hydrogène. Le principe du "qui se ressemble s'assemble", souvent rencontré en chimie permet encore d'expliquer ici la nature des phénomènes impliqués.

  • Considérons dans un premier temps un support indifférent (ce qui n'est pas le cas !). Dans la goutte, sont présents plusieurs composés dont certains sont polaires (P), d'autre moins, ou apolaires (A). Si l'éluant choisi est polaire, il fera migrer plus facilement le composé P, ayant plus de facilité à l'emmener dans la phase mobile.

On voit par cet exemple que la polarité de l'éluant tiens un rôle décisif lors de la migration des composés.

  • Considérons maintenant que la CCM est indifférente à l'éluant (!). Si seul le support compte, tout dépend de la nature des interactions entre les molécules du mélange et celles composant le support. Il s'agit généralement d'interactions de type liaison hydrogène. Supposons un support donneur d'hydrogène (D). Si dans le mélange se trouve des composés accepteur d'hydrogène (A), et d'autre indifférents (I), migreront plus facilement les composés indifférents aux liaisons hydrogènes.

La situation est souvent bien plus complexe que celle décrite dans les deux exemples précédents. Il n'existe donc pas de théorie pour la CCM permettant de choisir le bon éluant (c'est lui le plus dur à trouver !), le support étant généralement de la silice.


2. Choix des conditions opératoires

2.1. Choix du support

1l en existe trois principaux : silice, alumine et cellulose. Les supports sont généralement montés sur une plaque d'aluminium. Certaines plaques possèdent un colorant incolore en lumière naturelle mais de couleur verte en UV (ZnS absorbant à 256 nm).

Voici comment orienter son choix :

  • Silice : c'est le support le plus courant. Il est conseillé de toujours commencer par celui-là.
  • Alumine : on l'utilise généralement pour les composés à caractère basique.
  • Cellulose : on l'utilise pour les composés fortement polaires, comme les sucres ou les acides aminés.

2.2. Choix de l'éluant

Le choix de l'éluant est essentiel. Il n'est pas toujours fourni avec le mode opératoire et il est important de savoir le choisir. L'éluant est souvent un savant mélange de plusieurs (2 ou 3) solvants dans des proportions bien établies.

On a vu que le choix dépendait de la polarité. Voici le classement des principaux solvants par caractère polaire croissant.

  • Ether de pétrole
  • Cyclohexane
  • Tétrachlorure de carbone
  • Benzène
  • Toluène
  • Dichlorométhane
  • Ether diéthylique
  • Chloroforme
  • Acétate d'éthyle
  • Pyridine
  • Acétone
  • Ethanol
  • Méthanol
  • Eau
  • Acide acétique
Solvants
apolaires

 

¯
Caractère
polaire
croissant
¯

 

Solvants
polaires

Pour pouvoir comparer, voici à titre indicatif la polarité relative des principales familles de molécules organiques, par ordre croissant de polarité.

  • Alcanes
  • Dérivés halogénés
  • Cétones, aldéhydes, éthers et esters
  • Amides
  • Amines
  • Alcools
  • Phénols
  • Acide carboxyliques

Familles de
molécules
apolaires

¯
Caractère
polaire
croissant

¯
Familles de
molécules
polaires

2.3. Que faire quand on a aucune information pour réaliser la CCM ?

1. Le support à choisir est la silice.

2. Pour l'éluant, tester avec un mélange d'éther de pétrole (apolaire) et d'acétate d'éthyle (polaire) dans des proportions variées comme 100-0, 75-25, 50-50, 25-75, etc. Affiner ensuite avec un solvant plus polaire si nécessaire (acide acétique).


3. Réalisation d'une CCM

La CCM se déroule en trois étapes : préparation de la cuve, préparation de la plaque, et élution.

3.1. Préparation de la cuve

satur_cuve.gif (6871 octets)Un cuve de chromatographie se compose de la cuve et d'un couvercle. Le couvercle sert d'une part à éviter l'évaporation du solvant mais surtout à réaliser la CCM en atmosphère saturée (pression de vapeur saturante du solvant), de façon à avoir des valeurs reproductibles.

  • Préparer l'éluant en respectant les proportions du mode opératoire.
  • En placer 5 mm dans le fond de la cuve puis fermer le couvercle.
  • Éventuellement placer un papier filtre verticalement dans la cuve de façon à saturer l'atmosphère en vapeur de solvant.

3.2. Préparation de la plaque

Prenons l'exemple d'une plaque sur laquelle 4 taches sont à disposer.

  • Découper une plaque aux dimensions raisonnables 8 cm ´ 5 cm.
  • Tracer au crayon un trait à 1 cm du bas de la plaque.
  • Sur ce trait tracer 4 petits points à 1 cm de distance où seront déposés les taches.
  • Déposer à l'aide d'une micropipette (ou pipette Pasteur) les solutions sur chaque point, ou à l'aide d'un capillaire fabriqué in situ avec en tube en verre.

capillair_etir.gif (9539 octets)

Attention : les gouttes doivent être les plus petites possibles.

Attention : ne jamais toucher la plaque avec les doigts, surtout lors de la CCM d’acides a -aminés, mettre de gants.

Remarque : si la solution est trop diluée, mettre plusieurs gouttes au même point en prenant garde de laisser sécher entre chaque goutte. Remarque : si la solution est trop diluée, mettre plusieurs gouttes au même point en prenant garde de laisser sécher entre chaque goutte.

3.3. Elution

  • Placer la plaque dans la cuve, fermer et laisser l'éluant diffuser.
  • Arrêter la CCM lorsque le front d'éluant est arrivé à 1 cm du haut de la plaque (cette opération prend 15 min, mais dépend du support et de l’éluant).
  • Sortir la plaque et tracer au crayon le front de l'éluant.
  • Sécher la plaque au pistolet ou à la chaleur d’une plaque chauffante.

4. Révélation

Certains composés sont colorés : il n'est pas nécessaire de les révéler. La plupart sont incolores. Voici quelques méthodes utilisées pour révéler les plaques.

4.1. Révélation UV

  • Si la plaque est fluorescente, sous une lampe UV, toute la plaque apparaît verte sauf là où sont les taches que l'on entoure au crayon.
  • Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Placer la plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorés.

4.2. Révélation à l'iode

Beaucoup de composés organiques forment des taches jaune-marron en présence d'iode. Dans un flacon, placer la plaque et quelques cristaux d'iodes, puis boucher. Les taches apparaissent.

4.3. Révélation par atomisation

Cette technique utilise un atomiseur contenant le révélateur en solution. Selon le produit à révéler, la solution peut-être :

  • Ninhydrine pour les acides a -aminés (taches violettes qui brunissent pour disparaître en quelques jours)
  • Acide sulfurique à 50% pour à peu près tout (taches noires).
  • On utilise aussi des mélanges complexes d'oxyde de molybdène en présence de sulfate de cérium.

Précaution.  Lorsque l'on pulvérise le révélateur sur la plaque, se placer à 20 cm de la plaque et éviter toute formation de gouttelettes. Le révélateur doit-être appliqué en plusieurs pulvérisations.


5. Calculs et interprétation

La position finale da la tache (ou spot) est caractéristique de la molécule. On lui attribue une valeur, le Rf de Retention factor en anglais qui a été fort habilement traduit comme Rapport frontal. Ce Rf est le rapport de la distance parcourue par le composé divisé par la distance parcourue par l’éluant.

Front de solvant
­

(Spot) ·

  b ­
¯ ¯
Ligne de départ

Le Rf vaut : Rf = a / b

Le Rf est caractéristique d’une molécule pour un éluant et un support donnés. Cette valeur servira d’authentique lors de CCM d’identifications.


6. CCM à deux dimensions

Cette technique est souvent utilisée dans le cas de l'hydrolyse d'une protéine. Le mélange à séparer contient un grand nombre de composés que l'on veut séparer. Ici, une seule tache doit révéler le maximum d'information.

  • Dans un angle de la plaque, on réalise la tache.
  • On laisse éluer dans un premier éluant.
  • On tourne la plaque de 90° et on l'élue dans un deuxième éluant.

On obtient alors une cartographie de la protéine.


Bibliographie

  • Bounias 1983 - L'analyse biochimique quantitative par nanochromatographie en couche mince - Masson.

Bibliographie expérimentale

  • Levine S.G. 1990 - Identification of Unknows by Melting Point and Thin-Layer Chromatography in Combination  - J. Chem. Ed., 67, p. 972.
  • CCM de mélanges d'acides aminés.

 


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