Les techniques classiques de chromatographie sont la CCM, la CPG. Ici, en
chromatographie par perméation de gel, la sélection est faite non plus par la polarité
mais par la taille.
Nous allons utiliser un gel Séphadex qui laisse passer les molécules de grands
volumes, et fixe plus facilement les molécules de petite taille.
1. Préparation de la colonne de Sephadex
- Dissoudre 5 g de Sephadex dans 100 mL d'eau. Laisser la résine s'hydrater pendant 1h.
- Placer le Sephadex dans une colonne (~ 20 mm ´ ~ 200 mm)
possédant un fond en verre fritté. Lors du remplissage, bien faire attention à ne pas
faire de "trous" : le remplissage de la colonne doit-être parfaitement
homogène.
Remarque : la colonne n’est pas à usage unique. Elle peut-être réutilisée mais
doit être stockée avec une solution saturée de chlorure de sodium.
2. Préparation des solutions
2.1. Solution de diiode
- Dissoudre 250 mg de diode dans un mélange 50 mL d’éthanol / 50 mL d’eau.
- Placer le tout dans un compte goutte.
2.2. Solution d'amidon
- Dans un erlenmeyer de 250 mL, dissoudre 5 g d’amidon soluble dans 100 mL
d’eau.
- Porter à ébullition quelques minutes puis laisser refroidir.
- Filtrer puis placer dans un compte goutte.
3. Elution comparée d'amidon et de diiode
3.1. Elution du diiode
- Placer 5 gouttes de diiode sur la colonne de Séphadex.
- Eluer par de l’eau au goutte à goutte (attention à ne pas dégrader la colonne).
La quantité d’eau nécessaire doit être mesurée.
- Arrêter l’élution lorsque le diiode est évacué de la colonne.
On mesure un volume de 320 mL.
3.2. Elution de l’amidon
- Placer 5 gouttes de la solution d’amidon sur la colonne de Séphadex.
- Eluer par de l’eau au goutte à goutte (attention à ne pas dégrader la colonne).
La quantité d’eau nécessaire doit être mesurée.
- Arrêter l’élution lorsque l’amidon est évacué de la colonne. On testera la
présence d’amidon en mettant une goutte de diiode dans le flacon récupérateur en
dessous de la colonne.
On mesure un volume de 150 mL
4. Elution du complexe diiode-amidon
- Préparer un mélange de cinq gouttes d’amidon et dix gouttes de diiode.
- A l’aide d’une pipette Pasteur, placer cinq gouttes du mélange en haut de la
colonne.
- Eluer par de l’eau.
- On constate une séparation de l’amidon et du diiode.
